《新世纪福音战士》游戏以动画的17～24话与剧场版“Air真心为你”为基础。主角不是玩家熟悉的原作角色，而是隶属于NERV谍报部的探员剑崎恭也。故事从主角秘密运送EVA四号机到了NERV本部开始，面对恐怖份子的攻击、NERV内部暗藏的阴谋等，透过调查各个事件，逐渐解开原作中留下的种种谜团。玩家扮演的主角剑崎，在与美里、加持、律子、真嗣、零、明日香等人的交流之下，也逐渐产生了疑问……


《新世纪福音战士》随着游戏进行，主线会发展出三个故事：“基本路线”与TV与剧场版故事相同，玩家可以透过主角剑崎的观点，经由与EVA驾驶者与NERV其它成员的互动中，再次体验新世纪福音战士的世界观。在“主角路线”中，与美里、律子和加持曾为同窗的剑崎，发现自己也带有使徒的遗传因子，为此而苦恼着，并重新思考了自己的方向。“瞳路线”则是透过游戏里另一位新登场的原创角色，参与Dummy System和Dummy Plug开发的科学家加贺瞳的观点，在看到初号机与第14使徒的作战后，感受到的恐怖与威胁感。
庞大剧情架构+EVA知识补完
游戏分章节进行，三个故事共有37话。每个章节的一开始玩家将会获得一定数量的行动点数，无论是进行主线或支线剧情，都会消耗一点行动点数，如果行动点数消耗完毕，却无法完成该章节的主线剧情，游戏即宣告结束。游戏进行的过程中，主角可以提升与真嗣、零和明日香的关系，这也会触发不同的结局。
PC版的《新世纪福音战士》还加入了EVA问答游戏，共有三个难度等级，150题与EVA有关的问题。由明日香或零在各难度的题目中各抽出10题，通过3个等级后，就有机会得到精美的CG做为奖励。自认是EVA死忠粉丝的玩家，可以试试看自己对福音战士的了解成度。
剧情发展到一定程度后，玩家有机会看见以3DCG绘制，动画中消失的四号机出现，与初号机展开的精彩对决。而隐藏在NERV内的阴谋与人类补完计划所留下的种种谜团，在《机密档案》中，也会随着玩家的推理，逐步解开。在三部全新剧场版陆续推出前，《新世纪福音战士》即将补完EVA遗漏的篇章，一切真相都将得到答案。